Monitoramento de patógenos virais com tomografia crioeletrônica

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A pandemia do COVID-19 mostrou ao mundo inteiro como a pesquisa de vírus pode ser crítica. Anos de trabalho investigando SARS e outros coronavírus provaram ser a base inestimável que permitiu aos pesquisadores determinar a estrutura da proteína spike SARS-CoV-2 e desenvolver rapidamente vacinas que salvaram inúmeras vidas.

De muitas maneiras, o campo da virologia está passando por um renascimento, com muitas técnicas fundamentais evoluindo rapidamente nos últimos dez anos. Um contribuinte significativo para isso, além do crescimento catalisado por uma pandemia global, é a padronização e comercialização da preservação e análise de amostras criogênicas. Neste artigo, discutiremos a integração da microscopia crioeletrônica (crio-EM) na pesquisa em virologia e os desafios únicos de trabalhar com espécies perigosas de vírus em laboratórios de biossegurança.

Verificação de vírus precoce

Historicamente, as amostras de células e vírus foram preservadas por fixação química ou cristalização. Quando a análise de todo o vírus era impraticável ou impossível, a amostra era dividida em proteínas-chave para uma análise estrutural aprofundada. Embora essas técnicas tenham fornecido informações valiosas sobre a estrutura, o comportamento e a função dos vírus, elas estão divorciadas do contexto nativo em que o vírus atua. E embora isso fosse aceitável para partículas de vírus maduras e isoladas, isso nos deixou com lacunas em nossa compreensão das interações vírus-célula, principalmente depois que o vírus se internalizou na célula.

A reprogramação da maquinaria celular para a replicação do vírus é um processo complexo e altamente transitório. Mesmo que a imagem intracelular com fixação química seja possível, é um desafio capturar esses eventos fugazes, particularmente com detalhes suficientes para desvendar o que está acontecendo.

microscopia crioeletrônica

Na preparação de amostras criogênicas, as amostras aquosas são rapidamente congeladas para preservá-las em uma suspensão de gelo amorfo (vítreo). Ao contrário do gelo cristalino, que se expande à medida que se forma, as moléculas de gelo vítreo geralmente permanecem em suas posições de fase líquida, preservando a estrutura molecular circundante da amostra. Isso essencialmente tira um “instantâneo” da amostra em um estado quase nativo.

Para análise de vírus, a criopreservação tem sido fundamental no desenvolvimento de uma variedade de técnicas de microscopia eletrônica, amplamente descritas como crio-EM. A mais comum delas é a análise de partícula única, cujos desenvolvedores receberam o Prêmio Nobel de Química de 2017. A análise de partícula única usa a média para produzir estruturas moleculares 3D a partir de centenas de imagens de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) 2D. de diferentes cópias da amostra, aleatoriamente orientado dentro do gelo. De um modo geral, é considerado complementar à cristalografia de raios X, pois pode facilmente gerar estruturas para proteínas e complexos de difícil cristalização.

Embora a análise de partículas únicas tenha preenchido um nicho vital no mundo da análise estrutural, ainda é realizada em sistemas fragmentados isolados de seu contexto fisiológico. Felizmente, esta necessidade no lugar a observação pode ser acomodada por outra técnica complementar de crio-EM, a tomografia crio-eletrônica (crio-ET).

tomografia crioeletrônica

Na tomografia eletrônica, uma amostra fina é progressivamente inclinada e visualizada dentro de um TEM. Essas imagens representam diferentes seções transversais da amostra, que podem ser combinadas em uma única representação 3D de alta resolução da amostra. Enquanto a análise de uma única partícula depende de muitas cópias da mesma molécula alvo para capturar suas várias orientações, a tomografia deve usar um estágio de precisão que inclina de forma confiável uma única amostra em incrementos discretos.

Em particular, isso significa que a crio-ET pode ser realizada em um segmento de uma célula inteira preservada criogenicamente. Enquanto os primeiros experimentos crio-ET foram limitados a amostras inerentemente finas (ou regiões finas de amostras mais espessas), o advento de várias técnicas de crio-afinamento tornou possível cortar “janelas” diretamente em células congeladas para observar sua maquinaria intracelular.

Para a virologia, isso representa uma oportunidade única de capturar vírus indescritíveis em flagrante depois de entrarem no citoplasma da célula. Em particular, o crio-ET foi usado para estudar o comportamento de replicação do coronavírus dentro das células. Em uma colaboração liderada pelo Leiden University Medical Center, os pesquisadores conseguiram visualizar a formação induzida pelo vírus de vesículas de membrana dupla que são usadas para abrigar a replicação do RNA viral. Isso incluiu estruturas de poros na superfície das vesículas que provavelmente são responsáveis ​​pelo transporte de RNA, marcando-as como potenciais alvos de drogas.



Tomografia crioeletrônica revelando novas características de replicação de poliovírus.

Tomografia de visualização 3D de uma célula HeLa infectada com poliovírus. Capsídeos vazios: rosa, capsídeos cheios de RNA: vermelho, complexos de proteínas que ligam os capsídeos à membrana: amarelo, densidades intraluminais: laranja e grânulos densos repletos de vírions: azul. Imagem cortesia de Selma Dahmane, Universidade de Umeå.

Laboratórios de biossegurança: trabalhando com o inimigo

A crio-TE de vírus inteiros patogênicos e interações vírus-célula é naturalmente de grande interesse para os pesquisadores devido ao perigo claro e presente que os patógenos virais representam para a saúde humana em todo o mundo.

No entanto, os laboratórios de biossegurança definiram níveis discretos de perigo que várias amostras de vírus apresentam. O trabalho com patógenos que representam um risco de doença requer uma instalação de contenção de maior biossegurança, a menos que o trabalho seja limitado a isolados de proteínas ou amostras inativadas. Para garantir a segurança de todos que trabalham nessas instalações, os pesquisadores devem tomar precauções específicas e aderir a protocolos especiais, incluindo diferentes requisitos de instrumentos (como níveis estabelecidos de descontaminação). Como resultado, instrumentos crio-EM de alta qualidade ainda não são comumente encontrados nessas instalações de alto nível de biossegurança.

No entanto, alguns laboratórios têm mostrado resultados promissores na exploração de espécies patogênicas. Por exemplo, o grupo de pesquisa Carlson na Universidade de Umeå usou o crio-ET para estudar o poliovírus como um enterovírus modelo. Em seu trabalho, eles conseguiram capturar grande parte do ciclo de replicação do vírus dentro de sua célula hospedeira. Eles analisaram as maneiras pelas quais o vírus transformou o ambiente intracelular para facilitar a replicação viral. Ao visualizar esses mecanismos discretos, eles também foram capazes de ver a interação entre os mecanismos de defesa celular e a montagem viral. Por exemplo, a supressão de fatores naturais de autofagia permitiu que o vírus continuasse a se replicar, apesar dos gatilhos celulares para destruí-los. Este trabalho, possibilitado apenas pela crio-ET, abre caminhos emocionantes não apenas no desenvolvimento terapêutico, mas também em nossa compreensão fundamental das interações hospedeiro-patógeno.

“Imagine seguir um vírus desde seu contato com um hospedeiro, até a ligação celular, a replicação e a liberação. Apenas uma década atrás, isso pode ter sido considerado um sonho, mas estamos nos aproximando cada vez mais de uma compreensão mais completa do comportamento viral”. – Selma Dahmane, bolsista de pós-doutorado Marie Skłodowska-Curie, Universidade de Umea

O Cryo-ET abre a porta para novos insights tanto sobre vírus “conhecidos” cujas estruturas já podem ter sido determinadas, quanto sobre a infinidade de vírus que ainda precisam ser estudados. Muitas perguntas sobre seus ciclos de vida e interações com células hospedeiras permanecem sem resposta. Além de determinar a estrutura do próprio vírus, o crio-EM, incluindo o crio-ET, permite uma visão detalhada do ciclo de vida do vírus dentro de uma célula hospedeira, por exemplo, entrada, replicação, montagem e liberação. Também há muito a aprender sobre como as células respondem e se defendem contra infecções virais. Da mesma forma, estudar os efeitos de drogas ou candidatos a drogas nos ciclos de vida do vírus e nas defesas celulares pode nos preparar melhor contra o próximo grande vírus.

perspectivas

A virologia está pronta para entrar em uma nova era de descoberta com observações de estado quase nativo habilitadas por criopreservação e análise. A tomografia crioeletrônica, em particular, pode fornecer informações que unem nosso conhecimento atual da estrutura molecular e interação celular. A instalação de microscópios crioeletrônicos em instalações de biossegurança de alto nível permitiria a investigação de uma gama mais ampla de espécies de vírus. Com uma compreensão abrangente e em várias escalas da ação do vírus, podemos projetar tratamentos melhores, mais direcionados e eficientes. O acesso a essas informações não será isento de desafios, mas o esforço conjunto de experimentadores e desenvolvedores de instrumentos certamente nos impulsionará para esse futuro emocionante.

Sobre os autores

alex ilchev é o editor-chefe de ciência, Materiais e Análise Estrutural, na ThermoFisher Scientific.

Kristian Wadel é Gerente de Marketing de Produto, Materiais e Análise Estrutural da Thermo Fisher Scientific.

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